Konu: Peganum harmala L. (ÜZERLİK) TOHUMLARINDA HARMOL, HARMALOL, HARMİN VE HARMALİN

14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds. K.H.C.Başer ve N.Kırımer
Web’de yayın tarihi: Haziran 2004 ISBN 975-94077-2-8
Peganum harmala L. (ÜZERLİK) TOHUMLARINDA
HARMOL, HARMALOL, HARMİN VE HARMALİN
ALKALOİTLERİNİN YBSK YÖNTEMİ İLE ANALİZİ
M. Kartal, M. L. Altun, S. Kurucu
Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakognozi Anabilim Dalı, 06100 Tandoğan-Ankara
ÖZET
Harmol, harmalol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin ayırımı ve tayini için basit ve duyarlı bir yöntem geliştirilmiş ve geçerliliği kanıtlanmıştır. Bu alkaloitlerin 1.5 ml/dak. akış hızında, Metasil ODS YBSK kolonu (5 µm, 150 mm x 4.6 mm I.D.;MetaChem Technologies Inc.) kullanılarak ayırımı sağlanmıştır. Solvan sistemi olarak İzopropil alkol- Asetonitril- Su- Formik asit (100:100:300:0.3) (h/h/h/h) kullanılmış ve pH'sı trietilamin ile 8.6'ya ayarlanmış olup, UV 330 nm'de ölçüm yapılmıştır. Harmol, harmalol, harmin ve harmalin'in kalibrasyon aralığı sırasıyla 9.375- 250 µg/ ml, 30.750- 246 µg/ ml, 31.250- 500 µg/ ml ve 31.000- 248 µg/ ml olarak tayin edilmiştir. Bu çalışmada, geliştirilen yönteme göre Peganum harmala L. tohumlarında harmol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin teşhisi ve miktar tayini yapılmıştır.
GİRİŞ VE AMAÇ
Peganum harmala L. (Zygophyllaceae) tohumları halk arasında üzerlik olarak bilinmektedir. Ülkemizde halk arasında meyvelerinden nazarlık, tohumlarından ise nazara karşı tütsüyapılmaktadır (1, 2). Tohumlarda bulunan alkaloitler β-karbolin (trisiklik pyrido[3,4-b]indol) halka yapısı taşımaktadır (3). Bu alkaloitler; bazı gıdaların üretimi, işlem görmesi veya depolanması sırasında, indolaminler ile aldehit veya α-keto asitler arasında bir kimyasal kondensasyonla da oluşabilmektedir. Örneğin; norharman ve harman iyi pişirilmiş balık ve ette ng/g düzeyde; bazı alkollü içecekler ve gıda maddelerinde ise minör miktarlarda saptanmıştır (4). β-Karbolin türevi alkaloitlerin ayrımları ve analizleri; HPLC floresans veya UV detektör ya da bunların HPLC-MS kombinasyonları, GC ve GC-MS kullanılarak yüksek hassasiyet ve doğrulukla yapılabilmektedir (4,5). GC veya GC-MS yöntemlerini uygulamadan önce; uçucu türev hazırlanması ve türev oluştururken bazı artifact bileşiklerin oluşma ihtimali dezavantajdır. Bu nedenle HPLC veya HPLC-MS yöntemleri β-karbolin türevi alkaloitlerin analizlerinde daha çok tercih edilmektedir (4).
Harman ve benzer alkaloitler; seratonin antogonisti, hallüsinojen, merkezi sinir sistemi
stimulanı, ve kısa süreli MAO inhibitörüdür. 25-50 mg gibi küçük dozlar orta derecede
merkezi sinir sistemi stimulasyonu ve 1-2 saat boyunca uyku hali ve rüya görmeye neden
228olur. 750 mg’a kadar büyük dozlar hallüsinojenik etkiler oluşturur ve kişiye bağlı olarak
şiddeti değişmektedir (6).
MATERYAL VE YÖNTEM
Cihaz
Fakültemiz Merkez Laboratuvar'ında bulunan Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatograf; Jasco
model PU-980 pompa, Jasco UV-975 UV/VIS detektör, 7725 Rheodyne enjektör sisteminden (10 µl örnek hacimli) meydana gelmekte olup 330 nm'deki piklerin alanları Borwin software programı tarafından otomatik olarak hesaplanmıştır.
Standartlar
Harmol (H-1000), harmalol (H-0250), harmin (H-8646) ve harmalin (H-2256) standartları
Sigma firmasından temin edilmiştir.
Kromatografik Şartlar
Mobil Faz: İzopropilalkol- Asetonitril- Su- Formik asit (100:100:300:0.3) (h/h/h/h)
(Trietilamin ile pH'sı 8.6'ya ayarlanmıştır).
İzopropilalkol (Merck-101040), Asetonitril (Merck-100030) ve Formik asit (Merck-100264)
YBSK saflıkta, bidistile su kromatografik saflıkta kullanılmıştır. Solvanlar 0.45 µm filtreden
(Milipore, Milfod, USA) geçirilip ultrasonik su banyosunda degaze edilmiştir
Akış Hızı: 1.5 ml/dak.
Detektör: 330 nm
Basınç: 350 kg/cm
2
Hassasiyet: 0.02 AUFS
Kolon: Metasil ODS (5 µm, 150 mm x 4.6 mm I.D.;MetaChem Technologies Inc.)
Analizler eksternal standart yöntemi kullanılarak yapılmıştır.
Bitki Materyali
Bitki materyali 01.07.2001 tarihinde Van-Çavuştepe Kalesi'nden toplanmıştır (AEF 21702).
Ekstrenin Hazırlanışı
2g kurutulmuş ve toz edilmiş Peganum harmala'nın tohumları 1 saat süre ile 4 defa 50'şer ml
metanolle, 50 °C'de su banyosunda masere edildi. Tüm metanollü ekstreler birleştirilip
kuruluğa kadar uçuruldu. Yoğun ekstre 50 ml %2 'lik HCl'de çözüldü ve süzüldü. Süzüntü 2
kez 20'şer ml petrol eteri ile tüketilip çözeltinin pH'sı NH4OH ile 10'a ayarlandı. Sonra 4 defa 50'şer ml kloroform ile sıvı-sıvı ekstraksiyona tabi tutuldu ve kloroformlu faz kuruluğa kadar uçuruldu. Yoğun ekstre metanolde çözüldü, balonjojede hacim 25 ml'ye tamamlandı ve iyice alkalandı. Bu ekstre 0.45 µm'lik filtreden geçirilip 10 µl miktarda hassas olarak YBSK
kolonuna enjekte edildi.
Standart Çözeltilerinin Hazırlanması
Harmol (12.50 mg), harmalol (12.30 mg), harmin (12.50 mg) ve harmalin (12.40 mg)
standartları 25 ml'lik balon jojede solvan sisteminde çözüldükten sonra solvan sistemi ile 25
ml'ye tamamlanarak hazırlanmıştır..
Standart Çalışma Çözeltisi
250 µg/ml harmol, 246 µg/ml harmalol, 500 µg/ml harmin ve 248 µg/ml harmalin
konsantrasyonlarında standart çalışma çözeltileri hazırlandı. Kullanılan yöntemin uygunluğu
kapasite faktörü (k’), rezolusyon (R), selektivite (α) ve pik asimetrisi (T) hesaplanarak
kontrol edildi.
229Kalibrasyon Eğrisi
Solvan sistemi içinde hazırlanan harmol (9.375-250 µg/ml), harmalol (30.750- 246 µg/ml), harmin (31.250-500 µg/ml), harmalin (31.000-248 µg/ml) standartlarına ait kalibrasyon grafikleri elde edildi. Her bir standardın farklı konsantrasyonlarında 3'er kez 10 µl enjekte edilmesi ile elde edilen ik alanları saptandı ve buradan y= mX + n doğru denklemleri bulundu.
BULGULAR
Yöntem Geliştirme
Çeşitli oranlarda İzopropil alkol, asetonitril, su ve formik asitle ile hazırlanan solvan
sisteminin trietilaminle çeşitli pH'larda denenen tampon çözeltileri arasında en iyi ayırım ve
hassasiyet gösteren pH, 8.6 olduğu tespit edilmiştir. Buna göre de solvan sistemi olarak
İzopropil alkol- Asetonitril-Su- Formik asit (100: 100: 300: 0.3) (h/h/h/h) (Trietilaminle pH
8.6'ya ayarlı) sisteminin en uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
Akış hızları ile 0.5 ml/dak. ile 1.5 ml/dak arasında çeşitli ayırımlar denenmiş, 1.5 ml/dak.'lık
akışta optimum ayırım olduğu görülmüştür. Kullanılan ODS ters faz kolonunda harmol,
harmalol, harmin ve harmalin standartlarının retansiyon zamanlarının ortalaması sırasıyla
1.620 dak., 2.971 dak., 3.539 dak. ve 10.374 dak. olduğu görülmüş olup toplam analiz süresi
12 dakikadır.
Harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının UV'de çeşitli dalga boylarında yapılan
denemelerinde 330 nm'de maksimum bir absorbans gösterdiği ve tüm piklerin tamamen
ayrıldığı sonucuna varılmıştır (Kromatogram).
Doğrusallık
Tablo 1'de her standarda ait korelasyon değeri (r2), eğim ve kesişimin bağıl standart
sapmaları verilmiştir. Harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının sırasıyla 9.375-
250 µg/ml (r2= 0.9999), 30.750- 246 µg/ml (r2 = 0.9999), 31.250- 500 µg/ml (r2 = .9997) 230ve 31.000- 248 µg/ml (r2= 0.9999)
konsantrasyonlarda elde edilen pik alanları ile mükemmel bir doğrusallık sağlanmıştır.
Teşhis Limiti ve Miktar Tayini Limitlerinin Saptanması Teşhis edilebilecek en düşük miktar (TL) gürültü sinyalinin 3 katı, miktar tayini yapılabilecek en düşük miktar (MTL) gürültü sinyalinin 9 katı olarak bulunmuştur. Buna göre de harmol, harmalol, harmin ve harmalin için 6 enjeksiyon yapılmış olup teşhis edilebilecek en düşük miktarlar sırasıyla 3.125, 10.250, 4.690 ve 10.330 µg/ml; miktar tayini
yapılacak en düşük miktarlar da 9.375, 30.750, 15.630 ve 31.000 µg/ml olarak hesaplanmıştır
(Tablo 1).
Tablo 1. Sonuçların Doğrusallığı, Teşhis Limiti ve Miktar Tayin Limiti Bileşik λ Doğru Denklemi r 2Eğim (%RSD)Kesişim (%RSD)MTL µg/ mLTL µg/ mL
Harmol 330 Y= 9.929431 X + 16.99812 0.9999 0.383 2.390 9.375 3.125
Harmalol 330 Y= 6.446235 X - 43.9565 0.9999 0.241 1.539 30.750 10.250
Harmin 330 Y= 10.966 X - 12.3125 0.9997 0.297 11.486 15.630 4.690
Harmalin 330 Y= 12.51171 X + 14.57609 0.9999 1.961 2.003 31.000 10.330
X= Konsantrasyon ( µg/ mL); Y= Alan; λ= Dalga Boyu; r 2= Korelasyon değeri; %RSD= % Bağıl standart sapma; MTL= Miktar Tayin Limiti TL= Teşhis Limiti %RSD = (Standart Sapma/ Ortalama) x 100 Metodun Uygunluğu
Rezolusyon (R), selektivite (α) ve pik asimetrisi (T) gibi kromatografik parametrelerin bu
bileşikler için uygun olduğu görülmüşür (Tablo 2). İki pik arasındaki rezolusyon değeri
1.50'den, selektivitesi de 1.20'den düşük değildir. Kapasite faktörü (k’) harmol, harmalol,
harmin ve harmalin için sırasıyla 1.160, 2.962, 3.718 ve 12.831 olarak hesaplanmıştır.
Tablo 2. Harmol, Harmalol, Harmin ve Harmalin'in Sistem Performans Parametreleri
Bileşik
tr (n=9, ortalama )Alan (n=9, ortalama)k' R α T Harmol 1.620 (1.043)1146.4 (3.279).160 5.066 1.062(2.565)2.553 (1.317)Harmalol 2.971 (0.581)606 (4.436)2.962 .6251.528 (4.503)1.255
Harmin 3.539 (1.330)(1.629)1596.6 (2.662)3.718 1.754
Harmalin 10.374 (1.367)1398.8 (4.790)12.8317.202 (3.263) 3.452 (1.338) 2.778
*%RSD = Parentez içinde % bağıl standart sapma değerleri verilmiştir.
231Doğruluk
Metodun doğruluğu harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının miktar tayini
yapılabilecek en düşük konsantrasyonlarından 9 kez enjekte edilerek kanıtlanmıştır. Ayrıca
harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının miktar tayini yapılabilecek en düşük
miktarlardaki % bağıl standart sapmaları sırasıyla 1.680, 4.609, 2.711 ve 3.078 olarak
hesaplanarak kullanılan bu metodun doğruluğu kesinleştirilmiştir (Tablo 3).
Tablo 3. Geliştirilen Metodun Miktar Tayin Limitindeki Doğruluk Değerleri ( n= 9)
Bileşik λ Pik Alanı (n=9, ortalama) %RSD
Harmol 330 102.00 1.680
Harmalol 330 151.83 4.609
Harmin 330 138.44 2.711
Harmalin 330 394.72 3.078
Kesinlik
Sırasıyla 125 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 112.5 µg/ml konsantrasyonlardaki harmol,
harmalol, harmin ve harmalin standartlarından hazırlanan karışım test numunesi olarak 9 kez enjekte edilmiştir. Pik alanlarından harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının konsantrasyonları hesaplandı. Hazırlanan konsantrasyonlar ve hesaplanan konsantrasyonların % sapmaları da hesaplanarak Tablo 4'de verildi. Sonuçlar ± %5'in üstünde bir sapma
göstermediğinden bu metodun kesinliği kanıtlanmıştır.
Tablo 4. Geliştirilen Metodun Kesinlik Değerleri (n=9)
Bileşik
Hazırlanan
Konsantrasyon
µg/ mL
Hesaplanan
Konsantrasyon
µg/ mL
Ortalama ± SD
% RSD % Sapma
Harmol 125 118.92 ± 4.397 4.397 4.864
Harmalol 100 100.29 ± 3.876 3.864 0.290
Harmin 150 148.18 ± 2.926 1.975 1.213
Harmalin 112.5 112.5 ± 3.897 3.474 0.293
SD = Standart sapma
% Sapma = ( Hazırlanan Konsantrasyon - Hesaplanan Konsantrasyon) x 100
Hazırlanan Konsantrasyon
Semen Pegani Ekstresi
Ters faz YBSK ile Van'dan toplanan Semen Pegani'den hazırlanan ekstredeki; harmol,
harmalol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin teşhisi yapılmış ve sonuçta bu alkaloitlerden
harmol, harmin ve harmalin bulunduğu sonucuna varılmıştır. Ekstreye bu standartlar ayrı ayrı
ilave edilip ayrı ayrı enjeksiyon yapılarak adı geçen alkaloitlere ait retansiyon
zamanlarındaki piklerde büyüme olduğu tespit edilmiştir. Böylece harmol, harmin ve
harmalin alkaloitlerinin Semen Pegani ekstresindeki varlığı kesinleştirilmiştir. Sonuçlar
istatistiksel olarak ta değerlendirilerek bu alkaloitlere ait doğru denkleminden hareketle %
alkaloit miktarları her üçü için de hesaplanmıştır (Tablo 5).
232Tablo 5. Semen Pegani Numunesinde Bulunan % Alkaloit Miktarları
Bileşik Alan
(n= 3, ortalama)
% Alkaloit
Ortalama ± SD
Harmol 8705
(0.463)
1.094 ± 0.0049
(0.453)
Harmin 4163.5
(1.087)
0.476 ± 0.0056
(1.188)
Harmalin 6132.25
(2.496)
0.611 ± 0.0155
(2.546)
*%RSD = Parentez içinde % bağıl standart sapma değerleri verilmiştir.
TARTIŞMA
Geliştirilen metot; biyolojik materyalden harmol, harmalol, harmin ve harmalin'in teşhisi ve
miktar tayini için elverişli bulunmuştur. Metodun tekrarlanabilirlik yüzdesinin yüksek
olması, basit, duyarlı, hızlı ve spesifik olan bu metodun harmol, harmalol, harmin ve
harmalin içeren kombinasyonlara uygulanabileceği sonucuna varılmıştır.
Van'dan toplanan Semen Pegani ekstresinde harmol miktarının harmin ve harmalin
alkaloitlerine göre daha yüksek olduğu görülmektedir. Miktar olarak harmin alkaloitinin
miktarı diğer ikisine göre daha düşük bulunmuştur. Harmalol çalışma materyalinde
saptanmamıştır. Bunun nedeni; droğun kurutulması ve ekstraksiyon işlemleri sırasında
muhtemelen harmalol’un kolayca okside olarak harmol’e dönüşmesidir(5).
Üzerinde farmakolojik çalışmaların devam ettiği ve her geçen gün yeni aktivitelerin
saptandığı Peganum harmala bitkisi alkaloitlerinin analizi için geliştirdiğimiz yöntem, bu
konuyla araştırma yapacak kişilere yol gösterecektir.
KAYNAKLAR
1. Baytop, T.: Türkiye'de Bitkilerle Tedavi (Geçmişte ve Bugün), 2. Baskı, s.: 357, Nobel Tıp
Kitapevleri Ltd. Şti., İstanbul 1999.
2. Küsmenoğlu, Ş.: FABAD, J. Pharm. Sci., 21(2), 71-75 (1996).
3. Tanker, M., Tanker, N. :Farmakognozi Ders Kitabı, Cilt 2, s.: 148-149, Ankara
Üniversitesi Basımevi, Ankara, 1990.
4. Herraiz, T.: J. Chromatogr. A 881, 483-499 (2000).
5. Al-Shalmani, S.: Pharmacognostical Researches on the Seeds of Peganum harmala L. of
East Libya Originated, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi
(1999).
6. http://www.peyote.com/jonstef/maois.htm

Halk arasında üzerlik otu olarak da bilinen nazar otu, kök ve tohumlarından faydalanılıyor. Harmalin, harmin, harbamol ve peganin içeriyor. Bağırsak parazitlerini düşürücü, terletici ve adet söktürücü etkisi bulunuyor. Sinir sistemini rahatlatıcı olarak da kullanılabiliyor. Bu ottan elde edilen öz, ateş düşürücü özellik taşıyor. Bel ve baş ağrılarını dindiriyor, gözleri kuvvetlendiriyor, kalp çarpıntısını önlüyor, sinirleri teskin ederek, histeriye iyi geliyor. Nefes yolları hastalıklarına karşı da etkili olan üzerlik otu çayı, kan pıhtılaşması, damar tıkanması durumlarda da etkili oluyor. Ayrıca bayılma, sersemleme, yorgunluk ve halsizlik ile adale zafiyetine iyi geliyor.
Faydaları :
* Sinir sistemini uyarır.
* Balgam söktürür.
* Mide ve kulunç ağrılarında faydalıdır.
* Sulu egzamada şikayetleri giderir.
* Ruhsal sıkıntıları;
* Histeriyi giderir. Karın ağrısını geçirir.
* İdrar söktürür, böbrek ye mesane ağrısını hafifletir.
* Cinsel gücü artırır .Kadınların hamileliği kolaylaştırır.
* Regl (Adet) söktürür,
* Hemoroide etkilidir,
* Kalp çarpıntısı ve nefes darlığına iyi gelir.

Peganum Harmana ‘ ya Türkiye ‘ de yüzerlik yada üzerlik adı verilir.Bu bitkiden kurutulmuş kapsülleri evlerde kötü göze karşı asılı tutarlar. Afganistan, Azerbaycan, İran, Irak ve Türkiye ‘ de kem gözlere karşı bu üzerliğin dumanından da faydalınılır. Bu işlem yapılırken eski bir dua okunur. Bu dua Müslümanlar tarafından bilindiği gibi Zerdüştler tarafından da bilinir.
Üzerlik ve Orta Doğu'da bir Entheogen olarak kullanılmış olan modern Batı kültüründe, genellikle bir ad hoc Ayahuasca, ß-carbolines ile DMT dahil phytoindoles ve Güney Amerika karışımı oluşturmak için Banisteriopsis caapi bir analog olarak kullanılır. Türkiye ‘ de tohumundan kırmızı boya elde edilir, genellikle elde edilen kırmızı boya Batı Asya ‘ da halı boyası olarak kullanılır.Aynı zamanda yün boyamak için de kullanılır. Tohumlar su ile ayıklanır sarı bir floresan boya elde edilir. Alkolk ile ayıklandığında kırmızı bir boya elde edilir. Kökler ve tohumlar mürekkep ve dövme yapmak için kullanılır.
Peganum harmala bir analjezik ve antienflamatuar ajan olarak kullanılır. Yemen ‘ de depresyonu tedavi etmek için kullanılırdı. Peganum Harmala ‘ nın antidepresan katagorisindeki geri dönüşümlü bir inhibitör olduğu kanıtlanmıştır.
Peganum harmala nın tohumlarından çıkan duman, bakteri, bağırsak parazitleri ve kalıp yosunlarını öldürür. Antibakteriyel görev üstlenmektedir. Ayrıca tribolium castaneum'ların böceğinin üremesini engeller. antihelmintik (parazitik solucanları atmak için) kullanılır.
Bildirildiğine göre Eski Yunanlılar sıtma ve tenyalardan kurtulmak için peganum haramalayı kullanırlardı.
Harmin, Peganum harmala bir bileşiği mevcuttur, ultraviyole ışık altında fluoresces oluşturmaktadır. Bu da sıtm, protozoa gibi hastalıklara karşı oldukça etkilidir. protozoa karşı etkili olabileceğine dair kanıtlar vardır. Peganum harmala, vasicine (peganine) bulunan bileşiklerinin biri Leishmania donovani, potansiyel olarak sebep olabilen bir protozoon parazitine karşı güvenli ve etkili olduğu tespit edilmiştir. Peganine hidroklorür dihidrat güvenli olmasının yanı sıra, mitokondriyal transmembran potansiyel kaybı üzerinden L. donovani iki aşamada apoptozu bulunmuştur. Başka bir alkaloid harmin de bulunmuştur. Veziküler formda hücre içi parazit gibi olmayan ve non-nefrotoksik hepatotoksik doğa, harmide kayda değer bir etkinliği olmaması nedeniyle, insanlarda klinik uygulama için kabul edilebilir niteliktedir. Peganum Harmala ölüme de neden olabilir. protozoal East Coast ateş ile enfekte sığırlarda bir hayat kurtarıcı etkisi olduğu belirlendi ve 1992 yılında Afrika'da 1,1 milyon sığırın ölümüne yol açtı.
Ileri mekanistik çalışmalar gösteriyor ki : beta-carboline türevleri DNA Topoizomerazlar inhibe eder ve DNA sentezini engelleyebilir. Peganum harmalanın antioksidan ve antimutajenik özellikleri de vardır.
Peganum Harmala tohumları geleneksel olarak deri kanseri ve deri altı kanser tedavisinde zaman zaman kullanılmıştır.

Harmin:
Summenformel: C13H12N2O
Molmasse: 212,2 g/mol
LD50 (Maus): 28 mg/kg (i.v.)


Harmalin:
Summenformel: C13H14N2O
Molmasse: 214,3 g/mol